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可溶性白细胞介素2受体检测实验一夹心法ELISA

时间: 1627752602 来源: 蚂蚁淘 阅读 (192)

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实验方法原理将抗Tac特异性单克隆抗体Ab1吸附于固相载体,识别细胞培养上清或血清等标本中Tac并与之结合。应用辣根过氧化物酶标记的识别另一种Tac表位的特异性单克隆抗体Ab2识别固定于固相载体的Tac并与之结合。通过酶催化底物显色反映待检标本中游离Tac的水平。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 刺激外周血单个核细胞(PBMC)

取外周血10ml,肝素抗凝,常规分离单个核
细胞,加至24孔细胞培养板,2×106/孔,RPMI1640-10%FCS+PHA3μg/ml,Wellcome公司,37℃、5%CO2培养72小时,收集上清,-20℃保存待测。同时设未加PHA对照组。可选用病人血清为待测标本。
  
2. Ab1包被

用0.05MpH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗Tac特异性单克隆抗体(Ab1)稀释
至5μg/ml,加至ELISA板,100μl/孔,4℃包被72小时。
  
3. 封闭

1%BSA-PBS封闭,350μl/孔,37℃孵育2小时。
  
4. 加样

ELISA板用PBS-T洗液洗3次,PHA刺激单个核细胞培养上清及对照
组上清或病人血清倍比稀释至1∶1024,每一稀释度取100μl加至ELISA板。HUT-102B2细胞培养上清为阳性对照,RPMI1640-10%FCS培养液为阴性对照。37℃,孵育2小时,洗涤。
  
5. 加酶标抗体

于各反应孔加辣根过氧化物酶标记另一种抗Tac特异性单克隆
抗体Ab2以效价滴定的最佳稀释度稀释100μl。37℃孵育2小时,洗涤。
  
6. 加底物显色

各反应孔加新鲜配制ABTS底物溶液100μl,37℃,孵育15分
钟。
  
7. 终止反应

各反应孔加2%氟化钠终止液50μl。
  
8. 结果判定

首先肉眼观察反应孔内颜色,稀释梯度是否均匀。阳性、u性结
果是否明显。然后于ELISA检测仪上测各孔OD值(410nm)。
注意事项
1. 包被抗体活性要较高,否则影响本实验敏感性。
  
2. 经筛选比较,封闭液以1%BSA-PBS为好。
  
3. 酶标结合物应用前应进行效价滴定,选择最佳工作浓度。
  
4. 底物应选用灵敏度较高的供氢体如ABTS等。
  
5. 如有条件,酶标McAb可由生物素-McAb和亲和素-HRP系统代替,以增加实
验的敏感性。