| 实验步骤 | 在有少量酶标特异抗体但无法获得纯化抗原时，用该检测方法筛选特异性抗体最为有效（图1.1.4)。另外，这种方法也可利用那些结合同一抗原的不同单克隆抗体来绘制抗原表位图。 附加材料（其他材料见基本方案）包被抗体溶液（特异性针对待测种属免疫球蛋白的抗体，不结合抗原或标记抗体）碱性磷酸酶标记的针对抗原的特异性抗体 1.用50ul的2ug/ml或lOug/ml包被抗体溶液包被Immulon微量滴定板，并封闭板孔 2.用封闭缓冲液按1:5或1:200(V/V)分别稀释杂交瘤上清液、抗血清或腹水，配制待测抗体溶液。在已包被孔中加入50M1，室温下孵育2h以上，洗涤（见基本方案，步骤7)。 3.用封闭缓冲液配制20〜200ng/ml的抗原溶液。往抗体包被孔中加入50ul等量抗原溶液，室温下孵育2h以上，洗涤。 酶标抗体浓度应足够高，保证NPP为底物时在405nm下产生大约0•50吸光度单位/h的光强度，或MUP为底物时产生1000〜1500荧光吸光度单位/h。应注意在可得到试剂条件下设置阳性对照系统。 5.每孔中加入75ulMUP或NPP底物溶液，室温下孵育lh。然后，目测检查酶解作用或用分光光度计定量测定（见基本方案，步骤9)。如要检测低水平反应，酶解作用数小时或数天后再次测定。 6.检测出的抗原特异性抗体应重新筛选以确定是否为假阳性。每个阳性样本中，用捕获抗体包被4个板孔，并将待测抗体和包被抗体结合在一起（步骤1和2)。用抗原孵育2孔（步骤3)，另2孔用封闭缓冲液封闭，4孔内都加入酶标抗体和底物（步骤4和5)，Ih后检测显色反应。 |
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