| 实验方法原理 | 将抗Tac特异性单克隆抗体Ab1吸附于固相载体，识别细胞培养上清或血清等标本中Tac并与之结合。应用辣根过氧化物酶标记的识别另一种Tac表位的特异性单克隆抗体Ab2识别固定于固相载体的Tac并与之结合。通过酶催化底物显色反映待检标本中游离Tac的水平。 | ||||||||
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| 实验材料 | 抗体PHA 试剂、试剂盒 | 缓冲液洗涤液稀释液终止液 仪器、耗材 | 塑料板检测仪水浴箱冰箱CO2孵箱加样器
实验步骤 | 1. 刺激外周血单个核细胞（PBMC） 取外周血10ml，肝素抗凝，常规分离单个核细胞，加至24孔细胞培养板，2×106/孔，RPMI1640-10％FCS＋PHA3μg/ml，Wellcome公司，37℃、5％CO2培养72小时，收集上清，-20℃保存待测。同时设未加PHA对照组。可选用病人血清为待测标本。 2. Ab1包被 用0.05MpH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗Tac特异性单克隆抗体（Ab1）稀释至5μg/ml，加至ELISA板，100μl/孔，4℃包被72小时。 3. 封闭 1％BSA-PBS封闭，350μl/孔，37℃孵育2小时。 4. 加样 ELISA板用PBS-T洗液洗3次，PHA刺激单个核细胞培养上清及对照组上清或病人血清倍比稀释至1∶1024，每一稀释度取100μl加至ELISA板。HUT-102B2细胞培养上清为阳性对照，RPMI1640-10％FCS培养液为阴性对照。37℃，孵育2小时，洗涤。 5. 加酶标抗体 于各反应孔加辣根过氧化物酶标记另一种抗Tac特异性单克隆抗体Ab2以效价滴定的最佳稀释度稀释100μl。37℃孵育2小时，洗涤。 6. 加底物显色 各反应孔加新鲜配制ABTS底物溶液100μl，37℃，孵育15分钟。 7. 终止反应 各反应孔加2％氟化钠终止液50μl。 8. 结果判定 首先肉眼观察反应孔内颜色，稀释梯度是否均匀。阳性、u性结果是否明显。然后于ELISA检测仪上测各孔OD值（410nm）。 注意事项 | 1. 包被抗体活性要较高，否则影响本实验敏感性。 2. 经筛选比较，封闭液以1％BSA-PBS为好。 3. 酶标结合物应用前应进行效价滴定，选择最佳工作浓度。 4. 底物应选用灵敏度较高的供氢体如ABTS等。 5. 如有条件，酶标McAb可由生物素-McAb和亲和素-HRP系统代替，以增加实验的敏感性。 免责声明：本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部 或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。 版权声明：未经蚂蚁淘授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的，应该授权范围内使用， 并注明“来源：蚂蚁淘”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。 |
